在實(shí)際工作中，在金溶膠中加入蛋白質(zhì)后，會(huì )由于靜電、疏水和范德華力相互作用而引發(fā)其在金顆粒表面的自發(fā)吸附，這是膠體金標記得以進(jìn)行的基礎。離開(kāi)這個(gè)基礎，膠體金標記是沒(méi)辦法進(jìn)行的。

為了制備金顆粒標記的蛋白質(zhì)，通常先將將金懸浮液攪拌混勻（你肯定遇到過(guò)這種情況：如果顆粒比較大，放置一段時(shí)間會(huì )出現顆粒下沉，注意此處不是金顆粒形態(tài)發(fā)生變化導致的聚沉！而只是因為重力作用引起的正常金顆粒在溶液中的非均勻分布。因此標記時(shí)候需要混勻后使用），同時(shí)加入大量的蛋白質(zhì)。當金顆粒與蛋白質(zhì)分子結合時(shí)，隨著(zhù)金顆粒變得穩定和裸金顆粒的減少，特征波長(cháng)處的吸光度通常會(huì )下降。為了檢查吸附過(guò)程的完整性，并確定金顆粒是否完全被飽和標記，我們可以取一部分液體，并加入少量氯化鈉溶液。如果在加入氯化鈉后發(fā)生聚沉，則說(shuō)明金顆粒還有沒(méi)被蛋白吸附存在比較多的裸金顆粒，應該添加更多的蛋白質(zhì)來(lái)進(jìn)一步吸附裸金顆粒。最后，通常會(huì )添加聚乙二醇（PEG）或免疫反應阻斷劑，如BSA或脫脂奶粉溶液，來(lái)進(jìn)一步穩定蛋白質(zhì)結合后的膠體懸液。這些封閉蛋白基本會(huì )完全占據絕大分部分潛在的金-金復合物或金-蛋白復合物相互作用的剩余位點(diǎn)，從而防止了在存儲、檢測過(guò)程中的聚集或非特異性結合。

關(guān)于待標記蛋白用量，大部分研發(fā)人員通常的做法是：先確定防止Nacl造成的聚集的最少蛋白質(zhì)所需量，在此基礎上增加約10-20%的過(guò)量蛋白（霍里斯伯格和羅塞特，1977；De Mey等人，1981）。但這個(gè)確定蛋白具體用量多少的工作其實(shí)針對大部分項目或者新手研發(fā)人員來(lái)說(shuō)，已經(jīng)沒(méi)有太多必要去動(dòng)手再確定到底多少蛋白才是最少量，除非是項目蛋白成本很高，你可以去做個(gè)試驗往下走走好好降降成本。膠體金技術(shù)這么多年下來(lái)，N多的被后浪拍在沙灘上且已經(jīng)被曬得嘎嘣脆的研發(fā)前輩早已經(jīng)留下了適合絕大部分項目標記的蛋白使用量。通常來(lái)說(shuō)10ug/ml的用量已經(jīng)絕對能讓你的蛋白豐度夠到姥姥家了，筆者甚至試過(guò)3ug/ml的用量姥姥家都表示夠用了。但是需要注意的是，如果你使用的金溶液濃度比較高的話(huà)，還是需要相應按照適當的比例提高蛋白的使用量，否則姥姥就有可能告訴你蛋白用量有點(diǎn)點(diǎn)不那么給力了。

總體來(lái)說(shuō)，為了獲得比較理想的標記物之外，在用金顆粒標記蛋白質(zhì)時(shí)，需要考慮幾個(gè)參數：

(1)蛋白質(zhì)的pI，

(2)吸附過(guò)程的pH，

(3)標記反應中的蛋白質(zhì)的量。

一般認為，大多數蛋白質(zhì)可以在其等電點(diǎn)或附近最大限度地和膠體金顆粒進(jìn)行吸附（Norde，1986）。但是就pH這個(gè)參數，在金標記過(guò)程中再怎么強調也不為過(guò)，甚至可以說(shuō)“成也pH，敗也pH”.這個(gè)參數對憑金標記這個(gè)技能混江湖的人來(lái)說(shuō)絕對算得上是內家真氣般的存在。沒(méi)有一定程度的修煉是不好去江湖隨便飄的。甚至有些待標記蛋白的純度、性能決定了標記過(guò)程pH會(huì )出現和常規做法特別不一樣的要求，先舉例說(shuō)明如下：

A、對于許多蛋白質(zhì)，特別是抗血清來(lái)源的免疫球蛋白，平均pI是一個(gè)包含一系列pH值的范圍。因此，多克隆抗體制備可能具有與特定純化的單克隆抗體非常不同的平均pI。這一點(diǎn)相信廣大金標研發(fā)人員是有所體會(huì )的，通常就是多抗比較好標記，但是活性不盡如人意，單抗雖然沒(méi)多抗好標，但標記出來(lái)后效果喜人。原因就在于此。

B、另外一點(diǎn)，個(gè)別蛋白對pH非常挑剔，當你用第一步調整好pH的金溶液中加入蛋白后，一切反應都很和諧、美好，反應的頁(yè)面也很絲滑，但當你第二次加入封閉蛋白后滿(mǎn)懷希望的等待收貨美好的標記物時(shí)，詭異、慘烈的畫(huà)面通常會(huì )出來(lái)把你英俊瀟灑的臉摁花崗巖地面上摩擦一頓：你會(huì )發(fā)現溶液會(huì )慢慢的、逐漸的變成藍色、或者紫色，甚至會(huì )有沉淀析出，人品差的他最后直接會(huì )給你變成一汪清水！咦，他怎么就變色兒呢？他怎么能變色了呢！問(wèn)題是，你這一變色兒，你讓你旁邊新招來(lái)的實(shí)驗助手小妹妹對你那崇拜的眼神往何處安放？！是啊，他怎么就變色兒了呢？其實(shí)，這個(gè)問(wèn)題主要是就是待帶標記蛋白對pH非常敏感造成的，加入封閉蛋白后改變了溶液pH所致，需要你在加入封閉蛋白過(guò)程中持續穩定溶液的pH才能讓標記過(guò)程進(jìn)行下去。

就算你確定好了標記pH，咱們通常會(huì )加入碳酸鉀到金溶液里邊去，然后再攪拌。但是，我告訴你，你如果對你的pH計下手夠狠的話(huà)，你可以用探頭直接伸入到你的金溶液里邊，然后睜大眼睛瞅個(gè)faiwu分鐘，我保證你會(huì )看見(jiàn)一個(gè)魔幻的情況出現：你調整好的金溶液的pH它就像遙遠星空的星光一樣一閃一閃的在你眼前欻欻跳動(dòng)并且一直往下降。通常faiwu分鐘估計至少能給你掉個(gè)0.5個(gè)pH！厲害吧，刺激吧？是不是又聽(tīng)到了你那英俊的臉和花崗巖摩擦的呲呲聲！開(kāi)始我遇到這種情況就傻眼了，心想：這啥情況哇！那啥、實(shí)驗前我特意用清水洗手了三遍吶！看見(jiàn)小偷偷東西我也喊了呀！公交車(chē)上我也給老奶奶讓座了哇，過(guò)斑馬線(xiàn)我也沒(méi)闖紅燈撒。臥槽，肯定是過(guò)馬路的時(shí)候走在我身邊的老奶奶我沒(méi)扶她！其實(shí)不是我不想扶她，是她走路速度比我快！等你在心里對心靈徹底來(lái)一次滌蕩后，我們來(lái)處理這個(gè)問(wèn)題，原則就是：多次平衡，盡快結合。多次平衡控制pH的下降幅度，盡快結合縮短波動(dòng)時(shí)間。

雖然我們說(shuō)蛋白質(zhì)與金顆粒的標記沒(méi)有普遍一致的標準，但可以通過(guò)遵循下面這些一般準則來(lái)提高標記過(guò)程的效率：

(1)在pH的pI范圍內或略高于pI；但在實(shí)際中往往這個(gè)策略效果一般，真的勇者往往出其不意而獲得意外之喜。期待你也一樣！大膽往往能讓你成為整個(gè)實(shí)驗室最靚的仔！

(2)向金顆粒注入的蛋白質(zhì)量比氯化鈉破壞實(shí)驗時(shí)略高（約10%）；

(3)避免蛋白質(zhì)的高飽和，因為這可能會(huì )促進(jìn)結合材料的浸出；這點(diǎn)真的可以采納，10ug/ml用量絕對姥姥家夠了，甚至舅舅家也都夠了。省時(shí)間可以直接用這個(gè)量，省出寶貴時(shí)間給實(shí)驗助手培訓下理論和實(shí)驗注意事項的細節它不香嗎？

(4)通過(guò)測定溶液在特征波長(cháng)處的吸光度來(lái)評價(jià)金顆粒的吸附程度和聚沉程度；

(5)優(yōu)化每個(gè)蛋白質(zhì)-金顆粒偶聯(lián)物，來(lái)確定膠體的穩定性和活性。優(yōu)化工作是個(gè)細活，需要花時(shí)間和精力去做、熬，這是也絕大部分小白菜成長(cháng)為大神的最好的路、其實(shí)也是最好的捷徑。這個(gè)工作相當于在對標記工作做PDCA持續改進(jìn)，同時(shí)、他對你獲取、維持實(shí)驗室標記崗位的王霸之位有舉足輕重的作用，實(shí)踐出真知，真知出權威。

如此，只要是在每次標記的過(guò)程中出現詭異事件，江湖的朋友會(huì )不約而同的翹首以盼且眾望所歸于你身上，希望你重出江湖，一劍定乾坤！當然也少不了收獲你助手小妹妹那崇拜的眼光！